Microbiologia
Autor: Marcelo Nicolosi
Na edição anterior, a revista Controle de Contaminação ouviu especialistas para tentar esclarecer dúvidas relativas à garantia da qualidade na análise microbiológica de produtos farmacêuticos. Desta vez, abordaremos temas como descarte de materiais, testes, validação de métodos analíticos, programa de capacitação e legislação.
Controle de segurança
A constante observação das normas e atualização de procedimentos adequadamente registrados por todos os envolvidos no processo de análise microbiológica é um forte indício de que os resultados positivos na rotina de um laboratório vão se manter, à medida que os controles, as análises de tendência e os resultados encontram-se dentro dos limites estabelecidos na validação. É o que afirma Renato Cesar Cardoso Carnevalli, Analista de Qualidade do Laboratório de Microbiologia da Johnson & Johnson.
Para o Mestre em microbiologia Fernando Amaral, consultor técnico da Única Suporte, a garantia de resultados fidedignos em microbiologia é algo complexo e que requer conhecimento de causa, além das habilidades motoras do analista: "os testes microbiológicos farmacopeicos são bastante manuais e, portanto, faz-se necessário um treinamento para o analista adquirir uma performance desejada na rotina. Além disso, alguns testes e estudos deverão ser realizados para que se possa prevenir possíveis resultados falsos". Para Amaral, além das validações dos métodos utilizados para a contagem de microorganismo, testes limites e pesquisa de patógenos, os testes de fertilidade e esterilidade para os meios de cultura são exemplos de controles de segurança: "o uso de provas positivas para a contaminação em paralelo com a amostra é algo também recomendável. É importante o conhecimento de cada técnica utilizada, sua aplicação e o erro determinado". Ele destaca que a Farmacopéia Americana, nos capítulos 1223 e 1227, trata sobre as questões de validações de métodos microbiológicos alternativos e farmacopeicos, respectivamente. Aponta ainda que outras informações podem ser encontradas na Farmacopéia Brasileira - 4ª edição, capítulo V.5. - e demais aceitas no País. "Além destes compêndios, algumas normas ISO são muito bem-vindas, como a série ISO 14.644, sobre áreas limpas, a ISO 17025, sobre boas práticas de laboratório, e outras que padronizam formas de lavagem de materiais e seu processamento e reciclagem", afirma Amaral, que continua: "além da aplicação de todas as garantias necessárias para que um ensaio microbiológico possa ocorrer com segurança, um fator que influencia significativamente no resultado final é a amostra e suas réplicas e, como a contaminação de um produto não é homogênea, a forma de garantir um resultado real é ampliar a amostragem do lote". O consultor afirma ainda que os estudos de validação já prevêem isto de forma clara. A outra questão relevante que ele levanta sobre o tema para os resultados é se esta amostra será analisada em duplicata, triplicata ou mais: "o mínimo tolerável para um ensaio de contagem em placas, por exemplo, é em duplicata".
A Farmacopéia Européia, no seu capítulo 2.6.12 (contagem total de microrganismos aeróbicos), apresenta o plano de amostragem de 5 amostras, sendo que para a aprovação, nenhuma delas deve exceder 10x o limite especificado, e no máximo duas poderão apresentar resultados na linha marginal (menor que 10x o limite especificado). Este plano, segundo Amaral, prevê o erro analítico na contagem em placas: "o fato é que quanto maior o número de amostras analisadas de um lote, e se estas forem analisadas separadamente e em pelo menos duplicata, maior será a chance de acertos no resultado final".
Segundo Maximino Bernardes Neto e Sandra Rossitto, ambos gerentes da Medlab Laboratório de Análises Científicas, para que a microbiologia traga resultados de qualidade deve-se começar pela própria área destinada ao controle microbiológico: "o laboratório (espaço) tem que ser adequado; seus equipamentos e insumos devem ser qualificados e monitorados; o pessoal deve, de fato, ser competente e constantemente treinado; um sistema da garantia da qualidade precisa estar implantado, ser seguido e os registros atualizados, compreendendo, inclusive, aqueles relativos aos procedimentos operacionais, metodologias e respectivas validações, monitoramentos e medidas corretivas e de melhoria verificadas ao longo de sua atividade, seguindo-se o que preconiza a norma NBR ISO-IEC 17025. Seja este laboratório próprio ou terceirizado".
Para eles, a partir de premissas estabelecidas, o responsável pelo laboratório microbiológico, em sinergia com a garantia da qualidade, pela obtenção de resultados microbiológicos satisfatoriamente controlados, deve perseguir e garantir:
- A utilização de insumos e embalagens de fornecedores qualificados, que comprovem documentalmente a realização do controle microbiológico dos seus produtos, desde a produção, acondicionamento, transporte e entrega, através de análises microbiológicas para controle dos pontos críticos e do insumo entregue;
- A atribuição e utilização de uma área produtiva que não ofereça pontos críticos com risco de contaminação cruzada durante o processo produtivo, com áreas controladas para estoque, expurgo, material recolhido no mercado e área de embalagem. Toda essa área, contemplando o ar ambiente, as mãos dos profissionais e as superfícies de equipamentos e utensílios podem e devem ser monitoradas através de amostragens e análises periódicas.
- Que o pessoal de produção e limpeza (todos) receba treinamentos periódicos relativos às Boas Praticas de Higiene, através de palestras apostiladas, e que a eficácia destes treinamentos seja evidenciada através de testes pontuáveis que irão apontar a necessidade, ou não, de um reforço ao grupo, ou indivíduo, que possam colocar em risco, parte ou o todo, o controle microbiológico do processo produtivo e influenciar negativamente na qualidade do produto.
- Que as águas a serem consumidas em produção e a potável sejam controladas e analisadas com freqüência, e que o profissional do controle e manutenção destes sistemas conheça a fundo as instalações, a sua operação e a qualidade da água que trata e utiliza, levando em consideração que um sistema purificador da água de produção, indispensavelmente, seja validado, a começar pela Qualificação da Instalação (IQ), seguida pela Qualificação da Operação, Manutenção, Limpeza e Sanitização (OQ) e, por final, a Qualificação da Performance deste sistema (PQ). Este processo de validação demanda, pelo menos, 12 meses de trabalho, análises físico-químicas e microbiológicas e muita documentação.
- Com uma matéria-prima confiável, área produtiva adequada, pessoal competente e dedicado, processo validado e a qualidade da água de assegurada, as chances de se ter contaminação sob controle se conclui no controle microbiológico dos lotes do produto acabado.
Como parte do Sistema da Qualidade o laboratório deve dispor de um programa documentado para a manutenção, calibração e verificação de desempenho dos equipamentos, os quais devem ser realizados de acordo com o uso e histórico do equipamento e serão baseadas na necessidade, tipo e desempenho anterior de cada equipamento, detalham Maximino Bernardes e Sandra Rossitto, que concluem sobre o tema: "os equipamentos e instrumentos utilizados no laboratório devem ser qualificados e calibrados por empresas especializadas e habilitadas que atendam aos requisitos da NBR ISO 17025 e, preferencialmente, da RBC – Rede Brasileira de Calibração, e caso o laboratório disponha de equipe capacitada, a qualificação do equipamento poderá ser efetuada pelo próprio pessoal."
Legislação
Carnevalli, analista de qualidade de laboratório de microbiologia, cita a legislação: "para cada atividade temos as ISOs e farmacopéias e a legislação Anvisa, FDA, etc.". Ele acredita que a utilização destas normas está engatinhando, isto é, quando se quer que uma estrutura seja dinâmica, correta, produtiva e de qualidade, o primeiro passo é conhecer os requisitos mínimos necessários descritos na legislação.
Sandra e Bernardes ressaltam que a legislação pertinente se aplica aos produtos, especificamente, e conforme o segmento e tipo de contato ao usuário que se propõe cada um dos produtos em sua classe e grau de risco. Os parâmetros de normalidade microbiológica variam da mesma forma. Eles informam a legislação a ser seguida: ISO 17025, Boas Práticas de Fabricação - RDC 210, Boas Práticas de Laboratório – BPL, Boas Práticas de Laboratório Clínico – BPLC, dependendo do ramo de atividade da empresa. Segundo eles, as BPL – Boas Práticas de Laboratório primam pela prática do planejamento do estudo/ensaio, de uma equipe de profissionais comprovadamente habilitados, capacitados e comprometidos, a partir da aglutinação, registro e controle de todas as informações pertinentes ao produto ou substância (artigo-teste) a ser estudado/analisado frente ao sistema-teste proposto pelo método analítico e ao seu objetivo final, garantindo total rastreabilidade dos dados em todas as etapas do estudo, assim como a confiabilidade dos resultados obtidos ao final do processo analítico, a qualquer tempo. Ainda segundo os profissionais da Medlab, a equipe de estudos e de garantia da qualidade do laboratório, bem como o patrocinador dos estudos (cliente), sob ótica das BPL, assumem total responsabilidade pelos resultados, por conta de auditorias documentadas em todas as fases críticas do estudo, como condição primordial para liberação do produto com plena segurança ao usuário final e ao meio ambiente: "o compromisso do gerente da garantia da qualidade do laboratório, auditor do estudo, permanecerá comprometido com os resultados auditados e liberados por até 20 anos da sua realização", concluem sobre o tema.
Capacitação
Renato Carnevalli afirma que quando as empresas estão em fase de certificação de operadores, isto é, um grau a mais de compromisso dos operadores com a qualidade de produtos e serviços, "o operador certificado não necessita de averiguação de suas atividades. Ele faz a sua qualidade". O consultor Fernando Amaral ressalva que o pessoal que atua no CQ microbiológico deve receber treinamento em microbiologia básica, riscos inerentes às atividades com microrganismos, métodos preventivos de contaminação, além dos assuntos inerentes aos testes propriamente ditos: "de forma geral, um analista leva meses para internalizar todo o conhecimento necessário para a rotina, e mais alguns para dominar as técnicas analíticas".
O programa de capacitação do pessoal deve ser elaborado anualmente, com revisões e inclusões periódicas, através de um planejamento frente às expectativas e necessidades almejadas pela empresa. Este programa deve prever a capacitação, treinamento e reciclagem dos profissionais, com verificação da performance individual e do grupo através da aplicação de testes pontuáveis que indicarão o desempenho e eventuais ações de melhoria necessárias. Essa é a opinião dos gerentes da Medlab, Sandra e Bernardes. Para eles, todos os registros do programa de capacitação, treinamento e reciclagem devem ser evidenciados no livro de treinamento dos profissionais e devem estar disponíveis para acesso rápido e fácil, seja pelo profissional da área, seja por auditor ocasional.
Tipos de ensaios microbiológicos
Maximino Bernardes Neto e Sandra Rossitto afirmam que os métodos mais comuns e freqüentes de ensaios microbiológicos na rotina de uma empresa estão entre as contagens de bactérias e pesquisa de bolores e leveduras, de coliformes e identificação de patogênicos e fungos (pour plate ou filtração). Todavia, segundo eles, tão importante quanto o ensaio microbiológico de um produto é a avaliação do conservante, que pode ser efetuada através do ensaio de Desafio Microbiano do Conservante (challenge-test). Para certificação da eficácia na ação de desinfetantes ou esterilizantes, que deve garantir a qualidade de um ambiente controlado microbiologicamente – explicam os profissionais da MedLab - os testes de avaliação de atividade antimicrobiana, bacteriostática e fungicida são realizados por laboratórios capacitados e, nestes testes, desafia-se a eficácia do produto, mais comumente, frente aos microorganismos E.Coli, Staphylococcus aureus e Pseudomonas aeruginosa e Trichophyton mentagrophites. Eles relatam que também são realizados os ensaios microbiológicos para avaliação da atividade anti-séptica (reddish) frente ao microorganismo Staphylococcus aureus, para verificação da eficácia de enxaguatórios bucais e medicamentos de uso tópico em peles comprometidas. Para produtos estéreis, normalmente os injetáveis, entre outros testes, são realizados os ensaios de esterilidade com extração por filtração em membrana ou inoculação direta em tubos contendo os meios de cultura TSA (Soybeam-casein Digest Agar) e TSB (Soybeam-casein Digest Broth). Estes vêm sendo contemplados com o novo método de inoculação por sistema em canister fechado, comumente chamado sterites", que reduziria consideravelmente o risco de contaminação durante o procedimento de extração e inoculação da amostra.
Segundo Bernardes e Sandra, um estudo detalhado da metodologia a ser empregada deve ser realizado levando em consideração o tipo de método a ser utilizado, (por exemplo, pour plate), os possíveis erros que podem ser encontrados como erro de diluição, plaqueamento, incubação, operação e, considerando o tipo de teste microbiológico a ser utilizado, algumas características devem ser avaliadas e consideradas, como exatidão, precisão , linearidade, robustez, etc. Ainda segundo os profissionais da MedLab, quando existe apenas a necessidade de alguma adaptação da metodologia a ser empregada frente ao método farmacopêico, é importante que seja realizado um estudo comparativo entre as metodologias. A tabela I, fornecida por Sandra e Bernardes, ilustra quais são os parâmetros considerados importantes para a validação de um método analítico, dependendo do tipo de aplicação do ensaio microbiológico (qualitativo ou quantitativo).
sexta-feira, 14 de março de 2008
quinta-feira, 13 de março de 2008
INTRODUÇÃO À MICROSCOPIA ÓPTICA,COLORAÇÃO SIMPLES E DE GRAM.
INTRODUÇÃO:
O Microscópio óptico é um instrumento usado para ampliar, com uma série de lentes, estruturas pequenas impossíveis de visualizar a olho nu.
Um microscópio óptico pode ser simples ou composto: o microscópio simples possui uma única lente e só fornece uma imagem moderadamente aumentada do objeto que se está estudando; o microscópio composto consiste de uma série de lentes e fornece um aumento muito maior. Um microscópio composto consiste de partes mecânicas e ópticas.
A parte mecânica tem uma base que estabiliza o microscópio, uma coluna ou canhão que se estende da base para cima, e uma platina ou mesa na qual é colocado o objeto a ser examinado. As partes ópticas estão presas a coluna acima e abaixo da platina e são elas: oculares, objetivas, condensador e espelho. Em muitos microscópios o espelho e a lâmpada estão alojados, com segurança, na base do instrumento.
A ocular consiste de uma combinação de lentes que estão embutidas na extremidade superior do tubo do microscópio. O valor gravado tal como 12,5 x indica o aumento da ocular. As objetivas (pode haver três, quatro ou cinco) são uma combinação de lentes presas à extremidade inferior do tubo do microscópio. O valor gravado tal como 10x, indica o aumento da objetiva. Uma objetiva 10x usada em combinação com uma ocular 12,5x dá um aumento total de 125x. As diferentes objetivas atarraxam-se ao revólver, que por sua vez está preso à extremidade inferior do tubo do microscópio. Troca-se uma objetiva por uma outra pela rotação do revólver, de modo que quando uma objetiva é substituída outra entra em seu lugar.
O condensador é uma combinação de lentes situada abaixo da platina. Ele projeta um cone de luz sobre o objeto que está sendo observado. O condensador pode ser levantado ou abaixado por um mecanismo de cremalheira, de sorte que a luz pode ser focalizada no objeto. A passagem de raios marginais no condensador é impedida pelo diafragma – íris.
O espelho que está situado abaixo do condensador reflete os raios luminosos emanados da fonte de luz. Situado entre o espelho e o condensador existe um porta-filtros móvel.
Dois tipos de exames serão mencionados a seguir, o exame a fresco, onde o microorganismo está em condições normais, ou seja, viáveis, e o exame onde a placa está corada, que consiste no tratamento sucessivo de um esfregaço bacteriano, fixado pelo calor. Existem dois tipos de coloração de lâminas: a coloração diferenciada, que envolve mais de um corante, permitindo distinguir diferentes estruturas e tipos de células microbianas, pois, coram de cores diferentes. Permitem separar os microrganismos em grupos, pois distinguem pelo menos dois tipos de comportamento diferente, ou seja, microrganismos com características de coloração diferentes. Uma das técnicas mais importantes é a de Gram, e a coloração simples, onde se utiliza só um tipo de corante.
A coloração de Gram é um método que consiste no tratamento de uma amostra de uma cultura bacteriana crescida em meio sólido ou líquido, com um corante primário, o cristal violeta, seguido de tratamento com um fixador, o lugol. Tanto bactérias Gram-positivas quanto Gram-negativas absorvem de maneira idêntica o corante primário e o fixador, adquirindo uma coloração violeta devido à formação de um complexo cristal violeta-iodo, insolúvel, em seus citoplasmas. Segue-se um tratamento com um solvente orgânico, o etanol-acetona. O solvente dissolve a porção lipídica das membranas externas das bactérias Gram-negativas e o complexo cristal violeta-iodo é removido, decorando as células. Por outro lado, o solvente desidrata as espessas paredes celulares das bactérias Gram-positivas e provoca a contração dos poros da peptidioglicana, tornando-as impermeáveis ao complexo; o corante primário é retido e as células permanecem coradas. Em seguida, a amostra é tratada com um corante secundário, a safranina. Ao microscópio, as células Gram-positivas aparecerão coradas em violeta escuro e as Gram-negativas em vermelho ou rosa escuro.
A fucsina cora muitas bactérias Gram-negativas mais intensamente que a safranina, que por sua vez não cora prontamente algumas espécies de bactérias. O solvente etanol-acetona pode ser substituído por álcool 95%.
Na coloração simples, o esfregaço é corado com um só reagente, de modo todas as estruturas ficam coradas da mesma cor. Os corantes básicos, com o cromogénio carregado positivamente, são os preferidos, pois se ligam aos ácidos nucleícos e a certos componentes da parede celular.
Os objetivos desta coloração são elucidar sobre a dimensão, a forma e o arranjo das células microbianas.
Os corantes básicos mais usados são o azul de metileno (cora de azul), o violeta de cristal (cora de roxo), a fucsina (cora de vermelho), o roxo de metilo (cora de roxo) e o verde de malaquita (cora de verde).
OBJETIVOS:
Apresentação e identificação dos componentes do Microscópio óptico. Familiarizar-se com o uso do microscópio, fornecendo informações sobre técnicas de observação microscópica.
Conhecer princípios e técnicas de execução de preparações coradas para microscópio óptico.
Executar e observar colorações simples e colorações negativas.
Compreender princípios e química das colorações diferenciais.
Conhecer princípios e técnicas de execução de preparações a fresco para microscópio óptico.
Executar e observar a coloração de Gram para visualizar a dimensão, a forma e o tipo de associação, e para diferenciar os dois grupos de bactérias: Gram positivo e Gram negativo
Executar e observar preparações a fresco entre lâmina e lamínula para visualizar a dimensão, a forma e a mobilidade de células bacterianas.
MÉTODOS:
Qualquer tipo de técnica para execução de preparações coradas envolve três etapas idênticas e fundamentais.
– Executar o esfregaço
Um esfregaço consiste numa preparação seca de células microbianas numa lâmina de vidro. Primeiro é importante que as lâminas estejam limpas. Depois os microrganismos devem ser espalhados na lâmina em determinada concentração de modo que fiquem adequadamente separados uns dos outros. É absolutamente essencial evitar esfregaços espessos, considera-se que um bom esfregaço é aquele que, quando seco, aparece como uma fina camada esbranquiçada.
Esfregaços feitos a partir de meios de cultura líquidos ou sólidos implicam técnicas diferentes:
meios de cultura líquidos: mergulha-se a alça na a suspensão microbiana e coloca-se diretamente no centro da lâmina; depois espalha-se, com o mesmo instrumento, de modo a ocupar uma área de ±1cm2.
meios de cultura sólidos: coloca-se uma gota de água destilada no centro da lâmina; retira-se com a alça com uma pequena quantidade do inóculo e suspende-se e homogeneiza-se na gota; depois espalha-se a suspensão de uma forma idêntica à anteriormente descrita.
– Secar o esfregaço
A secagem é executada deixando a lâmina ao ar ou colocando-a na estufa. Pode colocar-se a lâmina sobre dois dedos da nossa mão que é mantida acima da chama do bico de Bunsen à distância que conseguirmos suportar a intensidade do calor. A secagem deve ser feita pois com calor moderado (37º C) para que a água seja evaporada lentamente e deste modo não ocorrer destruição ou distorção morfológica das células microbianas da preparação. É importante uma boa secagem antes de se proceder à fixação.
– Fixar o esfregaço
Esta etapa é essencial, pois se o esfregaço não está fixado ao vidro da lâmina ele vai ser removido durante a fase de coloração.
A fixação pelo calor permite preservar a forma do microrganismo, mas alguns componentes celulares podem ser danificados. Na fixação química (ex. etanol, formaldeído, glutaraldeído, etc.), geralmente, não há destruição da estrutura das células que ficam fixadas à lâmina.
Durante o processo de fixação pelo calor (este deve ser mais forte do que na secagem) são inativadas as enzimas que podiam alterar a morfologia celular, endurecidas as estruturas celulares para que não se alterem durante a coloração e observação, dado que as proteínas microbianas coagulam e fixam-se à superfície da lâmina. Para que as células fiquem aderentes ao vidro segura-se a lâmina de um lado e fazem-se 2 a 3 passagens pela chama do bico de Bunsen. Agora o esfregaço está pronto para sofrer o processo de coloração.
COLORAÇÃO SIMPLES:
• Identificar a lâmina.
• Preparar o esfregaço para ser corado (secagem e fixação).
• Colocar a lâmina no suporte próprio, cobrir a zona do esfregaço com o corante indicado (gota a gota); o tempo de exposição é aproximadamente de 1 minuto.
• Lavar com água corrente para remover o excesso de corante, mantendo sempre a lâmina paralela ao jacto de água para se reduzir a perda de fragmentos do esfregaço.
• Secar a preparação colocando-a entre duas folhas de papel de filtro, mas sem a esfregar (modo expedito e mais rápido).
• Observar a preparação ao MO com objetiva de imersão.
COLORAÇÃO DE GRAM:
• Identificar a lâmina.
• Preparar o esfregaço para ser corado (secagem e fixação).
• Cobrir o esfregaço com o cristal violeta (corante primário) e deixar atuar durante 1 minuto.
• Retirar o excesso de corante e colocar umas gotas de lugol (mordente) deixando atuar durante 1 minuto.
• Rejeitar o excesso de corante sem lavar a lâmina.
• Adicionar a mistura álcool-acetona (descorante), gota a gota sobre a lâmina inclinada, para lavagem do primeiro corante.
• Lavar com água corrente para parar a ação do descorante.
• Cobrir o esfregaço com safranina (corante de contraste) e deixar atuar cerca de 30 segundos.
• Lavar com água corrente sempre com a lâmina inclinada.
• Secar a lâmina entre duas folhas de papel de filtro, mas sem esfregar.
• Observar ao MO com objetiva de imersão.
PREPARAÇÃO A FRESCO:
• Identificar a lâmina.
• Secar a lâmina.
• Transferir o MO do meio de cultura para a lâmina.
• Colocar sobre o MO a lamínula, a fim de delimitar o meio onde o MO está.
• Observar ao MO no microscópio óptico.
DETERMINAÇÃO DA AMPLIAÇÃO E RESOLUÇÃO DA MICROSCOPIA ÓPTICA E LUMINOSA:
DETERMINAÇÃO DA AMPLIAÇÃO:
λ = 550 nm 1 μm _________ 10
λ = 0,55 μm x _________ 1000 nm
Ampliação da ocular = 10 μm
A1 = 4x10 = 40x
A2 = 10x10 = 100x
A3 = 40x10 = 400x
A4 = 100x10 = 1000x
DETERMINAÇÃO DA RESOLUÇÃO:
R1 = 0,55 / 0,1 = 5,5 μm
R2 = 0,55 / 0,25 = 2,2 μm
R3 = 0,55 / 0,65 = 0,84 μm
R4 = 0,55 / 1,25 = 0,44 μm
FONTES DE REFERÊNCIA:
www.microbiologia.ufba.br/aulas/Microscopia_%F3ptica.doc
www.cstr.ufcg.edu.br/histologia/microscopia.htm
www.dsif.fee.unicamp.br/~furio/IE607A/MO.pdf
pt.wikipedia.org/wiki/Microscópio_óptico
pt.wikipedia.org/wiki/exames_a_fresco
O Microscópio óptico é um instrumento usado para ampliar, com uma série de lentes, estruturas pequenas impossíveis de visualizar a olho nu.
Um microscópio óptico pode ser simples ou composto: o microscópio simples possui uma única lente e só fornece uma imagem moderadamente aumentada do objeto que se está estudando; o microscópio composto consiste de uma série de lentes e fornece um aumento muito maior. Um microscópio composto consiste de partes mecânicas e ópticas.
A parte mecânica tem uma base que estabiliza o microscópio, uma coluna ou canhão que se estende da base para cima, e uma platina ou mesa na qual é colocado o objeto a ser examinado. As partes ópticas estão presas a coluna acima e abaixo da platina e são elas: oculares, objetivas, condensador e espelho. Em muitos microscópios o espelho e a lâmpada estão alojados, com segurança, na base do instrumento.
A ocular consiste de uma combinação de lentes que estão embutidas na extremidade superior do tubo do microscópio. O valor gravado tal como 12,5 x indica o aumento da ocular. As objetivas (pode haver três, quatro ou cinco) são uma combinação de lentes presas à extremidade inferior do tubo do microscópio. O valor gravado tal como 10x, indica o aumento da objetiva. Uma objetiva 10x usada em combinação com uma ocular 12,5x dá um aumento total de 125x. As diferentes objetivas atarraxam-se ao revólver, que por sua vez está preso à extremidade inferior do tubo do microscópio. Troca-se uma objetiva por uma outra pela rotação do revólver, de modo que quando uma objetiva é substituída outra entra em seu lugar.
O condensador é uma combinação de lentes situada abaixo da platina. Ele projeta um cone de luz sobre o objeto que está sendo observado. O condensador pode ser levantado ou abaixado por um mecanismo de cremalheira, de sorte que a luz pode ser focalizada no objeto. A passagem de raios marginais no condensador é impedida pelo diafragma – íris.
O espelho que está situado abaixo do condensador reflete os raios luminosos emanados da fonte de luz. Situado entre o espelho e o condensador existe um porta-filtros móvel.
Dois tipos de exames serão mencionados a seguir, o exame a fresco, onde o microorganismo está em condições normais, ou seja, viáveis, e o exame onde a placa está corada, que consiste no tratamento sucessivo de um esfregaço bacteriano, fixado pelo calor. Existem dois tipos de coloração de lâminas: a coloração diferenciada, que envolve mais de um corante, permitindo distinguir diferentes estruturas e tipos de células microbianas, pois, coram de cores diferentes. Permitem separar os microrganismos em grupos, pois distinguem pelo menos dois tipos de comportamento diferente, ou seja, microrganismos com características de coloração diferentes. Uma das técnicas mais importantes é a de Gram, e a coloração simples, onde se utiliza só um tipo de corante.
A coloração de Gram é um método que consiste no tratamento de uma amostra de uma cultura bacteriana crescida em meio sólido ou líquido, com um corante primário, o cristal violeta, seguido de tratamento com um fixador, o lugol. Tanto bactérias Gram-positivas quanto Gram-negativas absorvem de maneira idêntica o corante primário e o fixador, adquirindo uma coloração violeta devido à formação de um complexo cristal violeta-iodo, insolúvel, em seus citoplasmas. Segue-se um tratamento com um solvente orgânico, o etanol-acetona. O solvente dissolve a porção lipídica das membranas externas das bactérias Gram-negativas e o complexo cristal violeta-iodo é removido, decorando as células. Por outro lado, o solvente desidrata as espessas paredes celulares das bactérias Gram-positivas e provoca a contração dos poros da peptidioglicana, tornando-as impermeáveis ao complexo; o corante primário é retido e as células permanecem coradas. Em seguida, a amostra é tratada com um corante secundário, a safranina. Ao microscópio, as células Gram-positivas aparecerão coradas em violeta escuro e as Gram-negativas em vermelho ou rosa escuro.
A fucsina cora muitas bactérias Gram-negativas mais intensamente que a safranina, que por sua vez não cora prontamente algumas espécies de bactérias. O solvente etanol-acetona pode ser substituído por álcool 95%.
Na coloração simples, o esfregaço é corado com um só reagente, de modo todas as estruturas ficam coradas da mesma cor. Os corantes básicos, com o cromogénio carregado positivamente, são os preferidos, pois se ligam aos ácidos nucleícos e a certos componentes da parede celular.
Os objetivos desta coloração são elucidar sobre a dimensão, a forma e o arranjo das células microbianas.
Os corantes básicos mais usados são o azul de metileno (cora de azul), o violeta de cristal (cora de roxo), a fucsina (cora de vermelho), o roxo de metilo (cora de roxo) e o verde de malaquita (cora de verde).
OBJETIVOS:
Apresentação e identificação dos componentes do Microscópio óptico. Familiarizar-se com o uso do microscópio, fornecendo informações sobre técnicas de observação microscópica.
Conhecer princípios e técnicas de execução de preparações coradas para microscópio óptico.
Executar e observar colorações simples e colorações negativas.
Compreender princípios e química das colorações diferenciais.
Conhecer princípios e técnicas de execução de preparações a fresco para microscópio óptico.
Executar e observar a coloração de Gram para visualizar a dimensão, a forma e o tipo de associação, e para diferenciar os dois grupos de bactérias: Gram positivo e Gram negativo
Executar e observar preparações a fresco entre lâmina e lamínula para visualizar a dimensão, a forma e a mobilidade de células bacterianas.
MÉTODOS:
Qualquer tipo de técnica para execução de preparações coradas envolve três etapas idênticas e fundamentais.
– Executar o esfregaço
Um esfregaço consiste numa preparação seca de células microbianas numa lâmina de vidro. Primeiro é importante que as lâminas estejam limpas. Depois os microrganismos devem ser espalhados na lâmina em determinada concentração de modo que fiquem adequadamente separados uns dos outros. É absolutamente essencial evitar esfregaços espessos, considera-se que um bom esfregaço é aquele que, quando seco, aparece como uma fina camada esbranquiçada.
Esfregaços feitos a partir de meios de cultura líquidos ou sólidos implicam técnicas diferentes:
meios de cultura líquidos: mergulha-se a alça na a suspensão microbiana e coloca-se diretamente no centro da lâmina; depois espalha-se, com o mesmo instrumento, de modo a ocupar uma área de ±1cm2.
meios de cultura sólidos: coloca-se uma gota de água destilada no centro da lâmina; retira-se com a alça com uma pequena quantidade do inóculo e suspende-se e homogeneiza-se na gota; depois espalha-se a suspensão de uma forma idêntica à anteriormente descrita.
– Secar o esfregaço
A secagem é executada deixando a lâmina ao ar ou colocando-a na estufa. Pode colocar-se a lâmina sobre dois dedos da nossa mão que é mantida acima da chama do bico de Bunsen à distância que conseguirmos suportar a intensidade do calor. A secagem deve ser feita pois com calor moderado (37º C) para que a água seja evaporada lentamente e deste modo não ocorrer destruição ou distorção morfológica das células microbianas da preparação. É importante uma boa secagem antes de se proceder à fixação.
– Fixar o esfregaço
Esta etapa é essencial, pois se o esfregaço não está fixado ao vidro da lâmina ele vai ser removido durante a fase de coloração.
A fixação pelo calor permite preservar a forma do microrganismo, mas alguns componentes celulares podem ser danificados. Na fixação química (ex. etanol, formaldeído, glutaraldeído, etc.), geralmente, não há destruição da estrutura das células que ficam fixadas à lâmina.
Durante o processo de fixação pelo calor (este deve ser mais forte do que na secagem) são inativadas as enzimas que podiam alterar a morfologia celular, endurecidas as estruturas celulares para que não se alterem durante a coloração e observação, dado que as proteínas microbianas coagulam e fixam-se à superfície da lâmina. Para que as células fiquem aderentes ao vidro segura-se a lâmina de um lado e fazem-se 2 a 3 passagens pela chama do bico de Bunsen. Agora o esfregaço está pronto para sofrer o processo de coloração.
COLORAÇÃO SIMPLES:
• Identificar a lâmina.
• Preparar o esfregaço para ser corado (secagem e fixação).
• Colocar a lâmina no suporte próprio, cobrir a zona do esfregaço com o corante indicado (gota a gota); o tempo de exposição é aproximadamente de 1 minuto.
• Lavar com água corrente para remover o excesso de corante, mantendo sempre a lâmina paralela ao jacto de água para se reduzir a perda de fragmentos do esfregaço.
• Secar a preparação colocando-a entre duas folhas de papel de filtro, mas sem a esfregar (modo expedito e mais rápido).
• Observar a preparação ao MO com objetiva de imersão.
COLORAÇÃO DE GRAM:
• Identificar a lâmina.
• Preparar o esfregaço para ser corado (secagem e fixação).
• Cobrir o esfregaço com o cristal violeta (corante primário) e deixar atuar durante 1 minuto.
• Retirar o excesso de corante e colocar umas gotas de lugol (mordente) deixando atuar durante 1 minuto.
• Rejeitar o excesso de corante sem lavar a lâmina.
• Adicionar a mistura álcool-acetona (descorante), gota a gota sobre a lâmina inclinada, para lavagem do primeiro corante.
• Lavar com água corrente para parar a ação do descorante.
• Cobrir o esfregaço com safranina (corante de contraste) e deixar atuar cerca de 30 segundos.
• Lavar com água corrente sempre com a lâmina inclinada.
• Secar a lâmina entre duas folhas de papel de filtro, mas sem esfregar.
• Observar ao MO com objetiva de imersão.
PREPARAÇÃO A FRESCO:
• Identificar a lâmina.
• Secar a lâmina.
• Transferir o MO do meio de cultura para a lâmina.
• Colocar sobre o MO a lamínula, a fim de delimitar o meio onde o MO está.
• Observar ao MO no microscópio óptico.
DETERMINAÇÃO DA AMPLIAÇÃO E RESOLUÇÃO DA MICROSCOPIA ÓPTICA E LUMINOSA:
DETERMINAÇÃO DA AMPLIAÇÃO:
λ = 550 nm 1 μm _________ 10
λ = 0,55 μm x _________ 1000 nm
Ampliação da ocular = 10 μm
A1 = 4x10 = 40x
A2 = 10x10 = 100x
A3 = 40x10 = 400x
A4 = 100x10 = 1000x
DETERMINAÇÃO DA RESOLUÇÃO:
R1 = 0,55 / 0,1 = 5,5 μm
R2 = 0,55 / 0,25 = 2,2 μm
R3 = 0,55 / 0,65 = 0,84 μm
R4 = 0,55 / 1,25 = 0,44 μm
FONTES DE REFERÊNCIA:
www.microbiologia.ufba.br/aulas/Microscopia_%F3ptica.doc
www.cstr.ufcg.edu.br/histologia/microscopia.htm
www.dsif.fee.unicamp.br/~furio/IE607A/MO.pdf
pt.wikipedia.org/wiki/Microscópio_óptico
pt.wikipedia.org/wiki/exames_a_fresco
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