INTRODUÇÃO À MICROSCOPIA ÓPTICA,COLORAÇÃO SIMPLES E DE GRAM.

INTRODUÇÃO:

O Microscópio óptico é um instrumento usado para ampliar, com uma série de lentes, estruturas pequenas impossíveis de visualizar a olho nu.
Um microscópio óptico pode ser simples ou composto: o microscópio simples possui uma única lente e só fornece uma imagem moderadamente aumentada do objeto que se está estudando; o microscópio composto consiste de uma série de lentes e fornece um aumento muito maior. Um microscópio composto consiste de partes mecânicas e ópticas.
A parte mecânica tem uma base que estabiliza o microscópio, uma coluna ou canhão que se estende da base para cima, e uma platina ou mesa na qual é colocado o objeto a ser examinado. As partes ópticas estão presas a coluna acima e abaixo da platina e são elas: oculares, objetivas, condensador e espelho. Em muitos microscópios o espelho e a lâmpada estão alojados, com segurança, na base do instrumento.
A ocular consiste de uma combinação de lentes que estão embutidas na extremidade superior do tubo do microscópio. O valor gravado tal como 12,5 x indica o aumento da ocular. As objetivas (pode haver três, quatro ou cinco) são uma combinação de lentes presas à extremidade inferior do tubo do microscópio. O valor gravado tal como 10x, indica o aumento da objetiva. Uma objetiva 10x usada em combinação com uma ocular 12,5x dá um aumento total de 125x. As diferentes objetivas atarraxam-se ao revólver, que por sua vez está preso à extremidade inferior do tubo do microscópio. Troca-se uma objetiva por uma outra pela rotação do revólver, de modo que quando uma objetiva é substituída outra entra em seu lugar.
O condensador é uma combinação de lentes situada abaixo da platina. Ele projeta um cone de luz sobre o objeto que está sendo observado. O condensador pode ser levantado ou abaixado por um mecanismo de cremalheira, de sorte que a luz pode ser focalizada no objeto. A passagem de raios marginais no condensador é impedida pelo diafragma – íris.
O espelho que está situado abaixo do condensador reflete os raios luminosos emanados da fonte de luz. Situado entre o espelho e o condensador existe um porta-filtros móvel.
Dois tipos de exames serão mencionados a seguir, o exame a fresco, onde o microorganismo está em condições normais, ou seja, viáveis, e o exame onde a placa está corada, que consiste no tratamento sucessivo de um esfregaço bacteriano, fixado pelo calor. Existem dois tipos de coloração de lâminas: a coloração diferenciada, que envolve mais de um corante, permitindo distinguir diferentes estruturas e tipos de células microbianas, pois, coram de cores diferentes. Permitem separar os microrganismos em grupos, pois distinguem pelo menos dois tipos de comportamento diferente, ou seja, microrganismos com características de coloração diferentes. Uma das técnicas mais importantes é a de Gram, e a coloração simples, onde se utiliza só um tipo de corante.
A coloração de Gram é um método que consiste no tratamento de uma amostra de uma cultura bacteriana crescida em meio sólido ou líquido, com um corante primário, o cristal violeta, seguido de tratamento com um fixador, o lugol. Tanto bactérias Gram-positivas quanto Gram-negativas absorvem de maneira idêntica o corante primário e o fixador, adquirindo uma coloração violeta devido à formação de um complexo cristal violeta-iodo, insolúvel, em seus citoplasmas. Segue-se um tratamento com um solvente orgânico, o etanol-acetona. O solvente dissolve a porção lipídica das membranas externas das bactérias Gram-negativas e o complexo cristal violeta-iodo é removido, decorando as células. Por outro lado, o solvente desidrata as espessas paredes celulares das bactérias Gram-positivas e provoca a contração dos poros da peptidioglicana, tornando-as impermeáveis ao complexo; o corante primário é retido e as células permanecem coradas. Em seguida, a amostra é tratada com um corante secundário, a safranina. Ao microscópio, as células Gram-positivas aparecerão coradas em violeta escuro e as Gram-negativas em vermelho ou rosa escuro.
A fucsina cora muitas bactérias Gram-negativas mais intensamente que a safranina, que por sua vez não cora prontamente algumas espécies de bactérias. O solvente etanol-acetona pode ser substituído por álcool 95%.
Na coloração simples, o esfregaço é corado com um só reagente, de modo todas as estruturas ficam coradas da mesma cor. Os corantes básicos, com o cromogénio carregado positivamente, são os preferidos, pois se ligam aos ácidos nucleícos e a certos componentes da parede celular.
Os objetivos desta coloração são elucidar sobre a dimensão, a forma e o arranjo das células microbianas.
Os corantes básicos mais usados são o azul de metileno (cora de azul), o violeta de cristal (cora de roxo), a fucsina (cora de vermelho), o roxo de metilo (cora de roxo) e o verde de malaquita (cora de verde).
OBJETIVOS:

 Apresentação e identificação dos componentes do Microscópio óptico. Familiarizar-se com o uso do microscópio, fornecendo informações sobre técnicas de observação microscópica.

 Conhecer princípios e técnicas de execução de preparações coradas para microscópio óptico.

 Executar e observar colorações simples e colorações negativas.

 Compreender princípios e química das colorações diferenciais.

 Conhecer princípios e técnicas de execução de preparações a fresco para microscópio óptico.

 Executar e observar a coloração de Gram para visualizar a dimensão, a forma e o tipo de associação, e para diferenciar os dois grupos de bactérias: Gram positivo e Gram negativo

 Executar e observar preparações a fresco entre lâmina e lamínula para visualizar a dimensão, a forma e a mobilidade de células bacterianas.
MÉTODOS:

Qualquer tipo de técnica para execução de preparações coradas envolve três etapas idênticas e fundamentais.

– Executar o esfregaço

Um esfregaço consiste numa preparação seca de células microbianas numa lâmina de vidro. Primeiro é importante que as lâminas estejam limpas. Depois os microrganismos devem ser espalhados na lâmina em determinada concentração de modo que fiquem adequadamente separados uns dos outros. É absolutamente essencial evitar esfregaços espessos, considera-se que um bom esfregaço é aquele que, quando seco, aparece como uma fina camada esbranquiçada.
Esfregaços feitos a partir de meios de cultura líquidos ou sólidos implicam técnicas diferentes:
meios de cultura líquidos: mergulha-se a alça na a suspensão microbiana e coloca-se diretamente no centro da lâmina; depois espalha-se, com o mesmo instrumento, de modo a ocupar uma área de ±1cm2.

meios de cultura sólidos: coloca-se uma gota de água destilada no centro da lâmina; retira-se com a alça com uma pequena quantidade do inóculo e suspende-se e homogeneiza-se na gota; depois espalha-se a suspensão de uma forma idêntica à anteriormente descrita.

– Secar o esfregaço

A secagem é executada deixando a lâmina ao ar ou colocando-a na estufa. Pode colocar-se a lâmina sobre dois dedos da nossa mão que é mantida acima da chama do bico de Bunsen à distância que conseguirmos suportar a intensidade do calor. A secagem deve ser feita pois com calor moderado (37º C) para que a água seja evaporada lentamente e deste modo não ocorrer destruição ou distorção morfológica das células microbianas da preparação. É importante uma boa secagem antes de se proceder à fixação.
– Fixar o esfregaço

Esta etapa é essencial, pois se o esfregaço não está fixado ao vidro da lâmina ele vai ser removido durante a fase de coloração.
A fixação pelo calor permite preservar a forma do microrganismo, mas alguns componentes celulares podem ser danificados. Na fixação química (ex. etanol, formaldeído, glutaraldeído, etc.), geralmente, não há destruição da estrutura das células que ficam fixadas à lâmina.
Durante o processo de fixação pelo calor (este deve ser mais forte do que na secagem) são inativadas as enzimas que podiam alterar a morfologia celular, endurecidas as estruturas celulares para que não se alterem durante a coloração e observação, dado que as proteínas microbianas coagulam e fixam-se à superfície da lâmina. Para que as células fiquem aderentes ao vidro segura-se a lâmina de um lado e fazem-se 2 a 3 passagens pela chama do bico de Bunsen. Agora o esfregaço está pronto para sofrer o processo de coloração.

COLORAÇÃO SIMPLES:

• Identificar a lâmina.
• Preparar o esfregaço para ser corado (secagem e fixação).
• Colocar a lâmina no suporte próprio, cobrir a zona do esfregaço com o corante indicado (gota a gota); o tempo de exposição é aproximadamente de 1 minuto.
• Lavar com água corrente para remover o excesso de corante, mantendo sempre a lâmina paralela ao jacto de água para se reduzir a perda de fragmentos do esfregaço.
• Secar a preparação colocando-a entre duas folhas de papel de filtro, mas sem a esfregar (modo expedito e mais rápido).
• Observar a preparação ao MO com objetiva de imersão.

COLORAÇÃO DE GRAM:

• Identificar a lâmina.
• Preparar o esfregaço para ser corado (secagem e fixação).
• Cobrir o esfregaço com o cristal violeta (corante primário) e deixar atuar durante 1 minuto.
• Retirar o excesso de corante e colocar umas gotas de lugol (mordente) deixando atuar durante 1 minuto.
• Rejeitar o excesso de corante sem lavar a lâmina.
• Adicionar a mistura álcool-acetona (descorante), gota a gota sobre a lâmina inclinada, para lavagem do primeiro corante.
• Lavar com água corrente para parar a ação do descorante.
• Cobrir o esfregaço com safranina (corante de contraste) e deixar atuar cerca de 30 segundos.
• Lavar com água corrente sempre com a lâmina inclinada.
• Secar a lâmina entre duas folhas de papel de filtro, mas sem esfregar.
• Observar ao MO com objetiva de imersão.

PREPARAÇÃO A FRESCO:

• Identificar a lâmina.
• Secar a lâmina.
• Transferir o MO do meio de cultura para a lâmina.
• Colocar sobre o MO a lamínula, a fim de delimitar o meio onde o MO está.
• Observar ao MO no microscópio óptico.
DETERMINAÇÃO DA AMPLIAÇÃO E RESOLUÇÃO DA MICROSCOPIA ÓPTICA E LUMINOSA:




DETERMINAÇÃO DA AMPLIAÇÃO:

λ = 550 nm 1 μm _________ 10
λ = 0,55 μm x _________ 1000 nm


Ampliação da ocular = 10 μm

 A1 = 4x10 = 40x

 A2 = 10x10 = 100x

 A3 = 40x10 = 400x

 A4 = 100x10 = 1000x



DETERMINAÇÃO DA RESOLUÇÃO:


 R1 = 0,55 / 0,1 = 5,5 μm

 R2 = 0,55 / 0,25 = 2,2 μm

 R3 = 0,55 / 0,65 = 0,84 μm

 R4 = 0,55 / 1,25 = 0,44 μm
FONTES DE REFERÊNCIA:

 www.microbiologia.ufba.br/aulas/Microscopia_%F3ptica.doc
 www.cstr.ufcg.edu.br/histologia/microscopia.htm
 www.dsif.fee.unicamp.br/~furio/IE607A/MO.pdf
 pt.wikipedia.org/wiki/Microscópio_óptico
 pt.wikipedia.org/wiki/exames_a_fresco